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| 尖锐湿疣实验室检查发布人：不再犹豫 发布时间：2003-12-3 13:47:15 在尖锐湿疣的实验室检查中，主要是通过观察病变组织结构的变化、细胞形态学变化、HPV抗原检查、以及HPV DNA检测等来进一步了解HPV感染状况。 1.细胞学检查 细胞学检查主要是通过观察外生殖器和／或肛门等部位脱落的上皮细胞或尖锐湿疣病变组织染色后细胞形态的变化，以判断是否有尖锐湿疣亚临床表现或尖锐湿疣。 (1) 检查方法 最常用于细胞学检查的方法是巴氏涂片法。女性患者取外阴和／或阴道分泌物，男性患者多采用病灶刮片或用生理盐水磨擦病灶涂片、尿道口印片，以获取脱落的上皮细胞，然后待干，经巴氏染色后进行细胞学检查。 (2) 结果判断 在光学显微镜下观察凹空细胞(见组织病理检查中)。若见到凹空细胞则为阳性。除凹空细胞外，还可见到病毒包涵体和角化不良细胞。病毒包涵体特征为在脱落的上皮细胞核内或核旁胞浆内可见圆形、椭圆形大小不等均质红染质块。角化不良细胞特征为细胞深伊红染色，核小而浓染。 (3) 临床评价 细胞检查找到凹空细胞对诊断尖锐湿疣有重要意义。有报道巴氏涂片细胞学检查的特异性达90％，但其敏感性差，对HPV感染者只有15％~50％为阳性。尽管凹空细胞出现在有HPV生殖道感染中具有诊断意义，但有许多HPV感染的组织、特别是哪些HPV潜伏感染的组织不出现凹空细胞。 2.人乳头瘤病毒抗原检测 HPV感染人体表皮细胞后，在细胞内增殖合成衣壳蛋白而成为HPV抗原成分。利用免疫酶染色可检测感染组织细胞内的HPV抗原成分，以了解有无HPV感染。 (1) 检查方法 用于检查HPV抗原(HPV衣壳抗原)的方法主要是免疫组化法。取病变组织用抗生物素蛋白—生物素轭合物法(ABC法)或过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP法)对HPV抗原进行免疫组化染色后观察结果。 (2) 结果判断 在光学显微镜下见到胞核内有棕黄色微细均匀颗粒为阳性细胞，即HPV抗原检查阳性。阳性细胞多位于表皮棘层中上部，多呈散在灶状分布。这些阳性细胞都是诊断性凹空细胞。 (3) 临床评价 免疫组化法检查HPV抗原阳性对诊断HPV感染或尖锐湿疣具有重要意义。由于HPV抗原免疫组化方法只能确认细胞核的衣壳蛋白，此衣壳蛋白仅出现在HPV生活周期中的一个阶段(在后期病毒颗粒中产生)，即抗原呈周期性表达，病变程度不同抗原量表达也不同，同时，这种方法需要大量病毒颗粒才出现阳性反应，此外，在制片过程中的处理也会使一些抗原丧失，故免疫组化法检出率较低，据一些资料报道HPV抗原检查的阳性率为48.9％—67.3％。因此，目前这种检测方法已很少应用。 3.人乳头瘤病毒抗体检测 到目前为此，尚不能用血清学方法对HPV感染进行确诊和HPV分型。尽管已有检测某些HPV亚型的血清抗体来了解HPV感染与否，但通过检测血清中HPV抗体的方法来诊断尖锐湿疣或HPV感染还有大量工作要做，其中最为重要的是HPV的抗原性以及对相关HPV亚型所产生的抗体敏感性、特异性和生物学稳定性等均有待深入研究(已如前述)。因此，血清中HPV抗体阳性的临床意义有待正确评价。 鉴于HPV与牛乳头瘤病毒有交叉抗原，1983年Baird等曾用牛乳头瘤病毒作为特异性抗原来检测HPV感染者血清中免疫球蛋白G(IgG)抗体，结果在肛门外生殖器疣病例组中95％呈阳性，在正常对照组中阳性者为10％，这一研究结果提示检测患者血清中HPV抗体IgG的水平有助于诊断尖锐湿疣。后来Willian等以HPVll病毒颗粒为抗原，采用ELISA方法检测尖锐湿疣患者血清中HPV特异性抗体，检出率为32.6％。目前用于检查HPV抗体研究较多的是HPVl6型，即用HPVl6型衣壳蛋白L1病毒样颗粒(L1 VLP)作为抗原来检测血清中相应的HPV IgG抗体，其次是HPV6／11型等。 Kimbauer等报告54例HPVl6 DNA检查阳性的女性以HPVl6L1／L2 VLP作为抗原用ELISA法检测其血清抗体，有59％呈阳性，而HPV DNA检测阴性组中仅6％呈阳性。 Heim等采用ELISA法检查了79例尖锐湿疣患者血清中抗HPV6／11 L1 VLP IgG、IgM和IgA抗体，并与87例非HPV感染病例组比较。结果在59例尖锐湿疣中抗HPVll L1 VLP抗原的IgG和IgM抗体阳性率分别为46％和67％，而在87例对照组中IgG/和IgM分别为12％和6％，当加入HPV6 L1 VLP抗原时，HPV6/11 DNA阳性患者血清IgG阳性率从46％提高到76％。IgA抗体阳性率低，与对照组比较无显著性差异。这一研究资料显示HPV6／11L1VLP抗原是进行血清学研究和检测型特异性抗体的有效抗原。 有学者研究发现，在HPV感染的早期，由于感染时间短，HPV还未诱导出抗HPV抗体的产生，故在血清中可能检测不到抗HPV抗体。随着HPV感染时间的延长，HPV诱导产生了抗HPV抗体，故可检测到血清中抗HPV抗体。Wikstrom等检测了47例男性现症尖锐湿疣患者和32例曾有尖锐湿疣病史患者的男性对HPV6型和HPVll型衣壳蛋白的血清IgG抗体，并与205例无生殖器尖锐湿疣病史的男性比较，结果，血清中抗HPV6型的IgG抗体在曾有尖锐湿疣病史的男性中为35％，在现症尖锐湿疣中为27％，而在对照组为10％。这表明抗HPV6 1gG抗体的出现发生在尖锐湿疣病期的晚些时候，同时IgG阳性也反映曾感染过这种病毒。 4.人乳头瘤病毒DNA检测 HPV的检查还可以取病变组织和／或局部组织粘液、分泌物进行HPV DNA检测。常用的有以下两种技术。 (1) 核酸分子杂交技术 在20世纪70年代末及80年代初，研究者们逐步找到一种具有较高特异性及较高敏感性诊断HPV的核酸分子技术。随后，经过不断研究，这种技术日臻完善，不仅能对HPV感染进行较为准确诊断，而且还能对HPV进行分型。 核酸分子杂交技术的关键是制备高特异性及高灵敏度的HPVDNA标记探针，这种探针可通过提取HPV DNA后纯化获得，也可通过人工重组表达和人工合成后纯化获得，然后用同位素或生物素进行标记，将已标记好的探针与待测标本在一定条件下进行杂交，根据放射性同位素及生物素的检测结果等来判定标本中是否存在互补的核酸链，以确定HPV DNA。用于检测HPVDNA核酸杂交技术中的方法有斑点杂交法、原位过滤杂交法、Southern印 迹法等。 尽管核酸分子杂交技术是检查HPV的常用方法，但该技术尚有不足之处，如操作程序较繁杂，需时较长，由于取材部位不同，病变时间长短不一，在有些病变组织中因DNA降解，所能检测到的DNA量较少，故其灵敏度、检测阳性率还有待进一步提高。 (2) 聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术(PCR技术)是1985年由美国人Mullis和Saiki创建的，这是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，又称之为基因扩增技术。 PCR技术的原理主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程是由DNA模板变性、模板与引物结合以及引物延伸3个步骤组成的不断重复的过程。每次重复的3个步骤称为1个周期，其中每1个步骤的转换则是通过温度的改变来控制的。由于每1个周期所产生的DNA均能成为下1个循环的模板，所以，PCR产物以指数方式增加，经过25-30个周期之后，理论上可增加109倍，实际上至少可扩增105倍，一般可达到10％107倍，结果可通过溴化已锭染色，紫外灯下观察或结合分子杂交技术来检测HPV DNA，以阳性或阴性来表示。 PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等特点。该项技术已在医学领域以及在皮肤病检查中广泛应用。目前认为PCR技术是检测HPV DNA及分型的最好方法。用新鲜病变组织、固定包埋的病理组织、分泌物或粘液等标本，采用PCR技术对HPV DNA的检测不仅用于临床HPV所致不同疾病、调查不同人群或个体HPV的感染率，而且更多地应用于HPV致病、致癌机理的研究中。大量研究表明用PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术，是当今用于尖锐湿疣以及HPV感染诊断最常用的有力工具。 5.组织病理学检查 在实验室检查中，尖锐湿疣组织病理学检查是另一种重药的检查方法。取病变组织制片后在光学显微镜下或电子显微镜下观察其组织结构和细胞学变化对尖锐湿疣诊断与鉴别诊断具有十分重要的意义。 (1) 光学显微镜观察 在光学显微镜下，经典的尖锐湿疣组织病理常表现为凹空细胞、棘细胞层肥厚和一些不典型细胞，其特征如下：①上皮呈疣状或乳头状增生，常伴有上皮脚延长、增宽呈假上皮瘤样增生。②表皮角化过度、角化不全、角化不良。局部可见角化不全细胞堆积，特别是角化不全层细胞核较大，显示一定的非典型性。部分病例在表皮各层可见到胞浆红染、核固缩深染的角化不良细胞。③棘细胞层不同程度增生肥厚。宋林红等认为在上皮细胞呈乳头瘤样增生时，如棘细胞形态大小基本一致，棘细胞出现核大、核仁大、细胞间桥明显，对尖锐湿疣具有诊断意义。如在上皮细胞增生性病变中部分棘细胞具有上述特点，则提示有HPV感染存在的可能。④基底细胞增生、层次增加，并有非典型性增生，核分裂增多。⑤真皮乳头常呈尖乳头、或呈钝圆，有的乳头融合呈实性片块。乳头部毛细血管增生扩张，血管上移紧贴表皮。真皮内特别是真皮浅层有多少不等的淋巴细胞及浆细胞为主的细胞浸润，可见少数中性及嗜酸性粒细胞。⑥在表皮内见到散在或群集的凹空细胞。 凹空细胞(Koilocyte)，有学者称为挖空细胞或空泡细胞。无论是细胞学检查(见前)还是组织病理学检查，凹空细胞的出现对诊断尖锐湿疣具有重要价值，有诊断性凹空细胞之称。 凹空细胞主要见于表皮浅层和／或棘细胞全层。典型的凹空细胞的形态等变化有以下特点：①细胞体积大，核大，单核或双核；染色深，核变形或不规则，轻度异形性，核边缘不齐，呈所谓“毛毛虫”状；②细胞核周围有空晕，为环状核周胞浆空化，少量胞浆围绕细胞核周围呈放射状细丝样贴附细胞核膜；③细胞边缘尚存带状胞浆；④越向表皮浅层凹空细胞之胞浆空泡化越明显，且细胞体积亦越大；⑤凹空细胞群集存在，但无细胞间水肿。这种变化与一般细胞水肿或空泡变性不同，后者成群存在，常伴有细胞水肿，而且无核肥大变化。 凹空细胞分型：Gross将凹空细胞分为Ⅵ型：I型表现为棘细胞大小正常，胞浆明显空泡化，核位于中心呈轮幅状；Ⅱ型表现为棘细胞和颗粒细胞大小不一，核固缩，核周胞浆空泡化；Ⅲ型表现为同等大小的细胞胞浆透明，核位于边缘似镰刀形；Ⅳ型表现为细胞凹空似蜂窝形表皮；V型表现为凹空细胞类似于寻常疣和扁平疣中所描述的凹空细胞之间的细胞；Ⅵ型表现为无空泡化细胞，核浓染，可见核内空泡形成。胡春梅等根据凹空细胞核的改变将凹空细胞分为Ⅻ型： I型为核无变化的凹空细胞(核正常)；Ⅱ型为核大而浓染的凹空细胞(核比正常同类细胞核大，核染色质增多)；Ⅲ型为核固缩凹空细胞(核比正常同类细胞核小，深染)；Ⅳ型为镰刀形核凹空细胞(核位于边缘，呈镰刀形)；V型为毛虫样核凹空细胞(核膜不光滑，有多个棘状突起)；Ⅵ型为双核或多核凹空细胞(细胞核内有2个核或2个以上的核)；Ⅶ型为核分裂凹空细胞；Ⅷ型为核淡染凹空细胞(核染色比正常同类细胞淡)；Ⅸ型为核消失凹空细胞(凹空细胞直径不减少)。上述9型中以Ⅳ、V、Ⅱ型出现的例数最多，在其所观察的95例尖锐湿疣组织病理切片中分别为75、74和61例次。最近，袁莉云等根据宫颈尖锐湿疣组织中凹空细胞的核异形程度，将凹空细胞分为I型和Ⅱ型。 I型凹空细胞核增大，但不超过底层细胞核的1倍，核形不规则，染色深，结构不清，可见双核，偶见病理性核分裂相，即以放大400倍为高倍视野，病理性核分裂相1—2个／5局倍视野；Ⅱ型凹空细胞核为底层细胞核的2-3倍，可见双核、多核、畸形核或巨核，有的核结构清晰，可见核仁，有的染色质超微结构有以下特征：上皮各层基本完整，基底层细胞核大，可见大而明显的核仁，并见核仁边集、核分裂相可见，线粒体部分肿胀，小空泡形成。少数细胞浆内可见游离核糖体。细胞间以大量桥粒相连。棘细胞形态不一，细胞核内染色质多少不等，可见有病毒颗粒不规则聚集成团，病毒颗粒呈球形，有致密的核心和衣壳，无囊膜。这种细胞核内染色质明显凝聚、近核周胞浆内线粒体高度肿胀、嵴消失，呈空泡状，且核周糖质颗粒消失，胞浆明显空泡化，呈典型“凹空”之改变。部分胞浆内游离核糖体增多，细胞表面有较多微绒毛。 王家璧等取尖锐湿疣病变组织制片后在JEM2000EX透射电镜下观察结果：尖锐湿疣表现为基底细胞明显增生，表皮各层细胞核增大、肿胀，可见1-4个大的核仁，有些核仁分裂成小块状，常染色质丰富。有些增生的核中可见1-3个核内小体，核内小体直径约 0.1-0.8um。还可见到2种颗粒，一种是染色质间颗粒，直径为25-30nm，通常数10个聚集成簇状分布在常染色质区域；另一种是染色质周围颗粒，直径50~80nm，周围有15-20nm宽的空晕，常单个出现在异染色质周围。胞质中线粒体肿胀，内质网扩张，糖原溶解，有些肿胀破裂的线粒体，高度扩张的内质网和溶解的糖原在核周形成透明区或空泡区，即光镜下所见到的凹空细胞。凹空细胞可出现在表皮各层，以棘细胞层和颗粒层多见。淋巴细胞游走入表皮，真皮浅层毛细血管扩张，其周围有淋巴细胞、组织细胞浸润。 陈毅男等曾对5例新近感染的尖锐湿疣进行病理切片电镜检查结果：中、表层细胞可见明显的核周空隙，空隙宽窄不等，其中除见部分扩张的内质网外，未见细胞器结构，而充之以无定形絮状的蛋白质。5例核内均未找到病毒包涵体。对在电镜下找不到病毒颗粒的可能解释是：组织内“病毒浓度低”，“病毒的周期性存在、成熟状况不同、分布不均”以及与电镜标本取材定位不当有关。 [本文为网友发言，不代表本站观点.] |
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